重组 C 因子内毒素检测试剂盒

产品名称：

 

重组 C 因子内毒素检测试剂盒

 

产品货号相关：

 

货号	描述	包装
CTC8106	重组 C 因子(rFC)荧光法 内毒素检测试剂盒	96T

 

产品描述：

 

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，是由菌体裂解后释出的毒素，是最为常

见的生物热原。如果高剂量的内毒素进入体内会导致严重的热原反应，引起人体发热、休克

甚至死亡。而且内毒素相比于细菌更加难以灭活，在制药和医疗器械等领域中需要对产品进

行严格的内毒素检测分析，以避免发生热原反应事故。

上个世纪 60 年代的研究人员发现鲎（马蹄蟹）的血液细胞和变形细胞能够与革兰氏阴

性菌内毒素发生凝结，认识到鲎的血液制品能够作为检测内毒素的方法，由此开发出的鲎试

剂（LAL）检测内毒素的方法在 70 年代得到认可并被世界各国广泛采用并认定为法定的细

菌内毒素检查方法。LAL 包括三种蛋白酶原，在内毒素作用下产生一个级联反应。内毒素首

先激活其中的 C 因子，C 因子活化后激活 B 因子，B 因子再将其中的凝固酶原转化为凝固

酶，由凝固酶使凝固蛋白原转化为凝固蛋白，产生凝胶。因此可以通过凝胶的形成来推断样

本中的内毒素水平。

 

但是鲎试剂也具有无法克服的缺点，LAL 除了能与内毒素发生反应之外，还会与（1-3）

-β-D-葡聚糖反应，造成假阳性结果。并且因为使用鲎血液作为原料，其成分复杂，由于地域

和季节等差异，不同批的次稳定性成为问题。再加上由于人类活动导致的海洋环境的破坏，

鲎数量种群也在不断减少，导致原材料获取的短缺。而随着人用和动物用的药物制剂及医疗

器械需求迅速增长，寻求一个替代 LAL 检测内毒素的有效方法变得越来越重要。重组 C 因

子内毒素检测试剂盒是一种不含动物制品的 LAL 替代方案，目前一些国家的药品管理机构

如美国 FDA 等已经许可将其作为内毒素检测的一种替代方法。

 

产品原理：

 

鲎 C 因子是一种丝氨酸蛋白酶原，与内毒素结合后被激活为丝氨酸蛋白酶，C 因子是

鲎血液凝血级联反应中的第一步，能够首先被内毒素所激活并启动下游的级联反应。

重组 C 因子内毒素检测试剂盒主要由重组 C 因子和荧光底物等部分组成。重组 C 因子

是以基因重组的方式表达的 LAL 试剂中的 C 因子，C 因子被内毒素激活后切割荧光底物产

生游离荧光基团，通过检测荧光信号可以反应激活后的蛋白酶活性，并由此可以推算出内毒

素的含量。

 

特点及优势：

 

重组 C 因子内毒素检测试剂盒检测方法简单，反应快速，避免了 LAL 可能出现的假阳

性结果，具有更高的特异性，更好的精密度和准确度，且不依赖于动物源性成分，具有以下

特点：

1. 使用荧光测定，与其它定量 LAL 方法相当；

2. 检测方法简单，操作便捷；

3. 可进行多个样本的检测，反应时间短；

4. 检测灵敏度好，最低可到 0.005 EU/mL；

5. 具有更好的精密度和准确度；

6. 特异性好，无 G 因子β-葡聚糖假阳性干扰情况；

7. 不依赖于动物源成分，避免试剂来源受限，可稳定且持续提供；

8. 重组表达生产，产品批间一致性较好，避免动物来源成分不稳定问题

 

方法简介：

 

检测在 96 孔板中进行，加样后在分别在零小时和 37℃孵育一小时后使用酶标仪设定激

发/发射波长 380/440nm 检测每孔荧光值。用内毒素工作标准品和样品的荧光差值（ΔRFU）

减去阴性对照的 ΔRFU 得到净 ΔRFU。净荧光差值 ΔRFU 的对数与内毒素浓度的对数呈比

例，且在 0.005 至 5 EU/ml 范围内呈线性，利用已知内毒素工作标准品浓度的对数和 ΔRFU

的对数做标准曲线，ΔRFU 对数为纵坐标，内毒素标准品浓度对数为横坐标，方程即 log

（ΔRFU）=A*log（内毒素浓度 EU/mL）+B，标准曲线相关系数 r 2 应≥0.980。根据标准曲

线可以计算样品中的内毒素浓度。

 

 

操作步骤：

 

内毒素工作标准品制备

1. 内毒素工作标准品冻干粉按照内毒素含量加入对应体积的无热原水，可稀释为5 EU/mL浓度，旋涡振荡≥15 min；

2. 使用一次性无热原安瓿瓶稀释内毒素工作标准品，切勿使用塑料管稀释内毒素。使用无热原检查用水将标准品依次10倍梯度稀释为0.5，0.05，0.005 EU/mL浓度。

注意：因内毒素具有疏水结构，在稀释后需要将内毒素溶液充分旋涡振荡≥1 min，再继续进行下一步稀释与振荡混匀。

标准品及待测样品加入96孔板

1. 将100 μL阴性对照（无热原水）、不同浓度内毒素标准品、待测样品分别加入96孔板相应孔中，可做2-3复孔。同时可在样品孔中加入10 μL 5 EU/mL浓度内毒素标准品作为加标样品孔。

2. 加样后将96孔板放置于37℃恒温孵育器或培养箱中，预热10分钟。

配制rFC检测工作液

在样品预热期间配制rFC检测工作液：

1. 进行实验前需将rFC酶溶液，反应缓冲液和荧光底物溶液提前取出平衡至室温；

2. 配制工作液按照5:4:1的比例混合rFC酶溶液，反应缓冲液和荧光底物溶液，轻轻地充分混合，切勿使用旋涡振荡混合。测定体积可参考下表：

测定孔数	rFC酶溶液 μL	反应缓冲液μL	荧光底物溶液 μL	总体积 μL
6	500	400	100	1000
12	800	640	160	1600
24	1400	1120	280	2800
36	2000	1600	400	4000
42	2300	1840	460	4600
48	2600	2080	520	5200

注意：工作液试剂请现配现用，根据实际用量计算配制总体积。

加入rFC工作液

1. 取出预热的样本96孔板，将配制好的rFC工作液加入标准品以及样品孔，每孔100μL体积。

2. 工作液加样结束后将96孔板放置于37℃孵育器或培养箱中，孵育1小时进行荧光值检测。

荧光检测参数设定

1. 设置酶标仪检测参数如下：

关键参数	设置
激发波长	380 nm
发射波长	440 nm
光学位置	Bottom
每个孔的扫描次数	6
扫描前的延迟（毫秒）	150
两次扫描之间的延迟（毫秒）	1
震荡	读数前震荡5秒

2. 以Molecular Devices公司型号SpectraMax M3酶标仪参数为例：

关键参数	设置
Read Modes	FL
Read Type	Endpoint
Wavelengths
Excitation	380 nm
Emission	440 nm
Plate Type	96 wells
PMT and Optics
PMT Gain	Automatic
Flashers/read	6
Read From Bottom

数据分析

1. 所有标准品及样品孔孵育1小时后的 RFU值减去阴性对照孔（0 EU/mL）的RFU值，得到标准品和样品的ΔRFU值。

2. 计算内毒素工作标准品的ΔRFU值和浓度（EU/mL）的以10为底的对数；

    3. 以内毒素工作标准品浓度的对数log（内毒素浓度EU/mL）为横坐标，荧光值的对数log（ΔRFU）为纵坐标绘制标准曲线图进行线性拟合，log（ΔRFU）=A*log（内毒素浓度EU/mL）+B，标准曲线相关系数r2应≥0.980，示例如下：

 

 

Y=0.9685*X + 3.043    r2=0.9994

 

4. 通过标准曲线，计算样品与加标样品的内毒素含量，加标回收率%=（加标后样品内毒素浓度-未加标样品内毒素浓度）/实际加标内毒素浓度×100%，如内毒素的加标回收率在50-200%范围内时，即认为对检测没有干扰，检测出的样品结果可靠。